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传统固态白酒酿造体系是天然的微生物育种平台，其独特的多压力胁迫（高酸、高渗、高乙醇、高温等）微环境为菌株自然定性进化提供了良好的条件。这些具有高耐受性的功能菌株在酿造过程中发挥着重要作用，与发酵品质息息相关，决定了基酒产量和质量。更为重要的是，为科学理解细胞耐受调控分子机制提供了独一无二的研究素材。

(资料图)

微生物经过长时间自然驯化已经进化出了一套可以快速响应胞外环境变化的调控机制，以确保细胞可以在最短时间内根据外界压力因子的变化来调节细胞自身的代谢和状态，从而确保细胞的繁衍和生存。众所周知，细胞膜是细胞感受、响应胞外酸胁迫因子的前沿哨所，膜上的功能区域空间结构具有实时动态变化的特点，而且这些空间结构与传感元件功能的发挥息息相关。然而，关于细胞耐酸性能的研究多集中在胞内的响应调节，而细胞膜有哪些结构或是元件参与其中，是如何将压力信号传递进细胞，进而引起细胞内的应激反应却鲜有报道。天津科技大学现代酿造技术团队张翠英教授课题组首次报道了酱香型白酒酿造功能微生物粟酒裂殖酵母在酸胁迫下细胞膜亚结构Eisosome动态变化以及其与细胞耐酸性能的关联机制。该文章于2022年10月8日以“The eisosomes contribute to acid tolerance of yeast by maintaining cell membrane integrity ”为题在Food Microbiology（IF=6.374）上发表。

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有机酸扰动引起Eisosomes结构动态变化

比较转录组数据表明在高耐酸菌株Sp.65与实验室菌株S. pombe ATCC16979中，Eisosome结构元件pil1、pil2、fhn1、sle1、eis1和meu14的表达水平存在显著变化（图1），这暗示着细胞的耐酸性与Eisosomes之间可能存在一定的关系。

图1. Eisosomes结构基因在高耐酸菌株和实验室菌株中表达变化的验证

支架BAR结构域蛋白是Eisosome的基本组成元件。在S. pombe中，BAR结构域蛋白由pil1编码。为了进一步探究Eisosomes是否与菌株的有机酸耐受性存在联系，以Sp.65为出发菌株，采用绿色荧光蛋白EGFP标记Pil1，并用CLSM对Pil1-EGFP进行成像观察。与对照相比，加入乙酸导致了不规则的Eisosomes结构，且荧光信号迅速显著降低，这反映了Eisosomes对酸胁迫的快速响应。

图2 酸胁迫下的Eisosomes动态变化。不同酸处理下携带Pil1-EGFP的Sp.65的荧光显微镜(a)和荧光强度FI(b)。(c)乙酸和乳酸胁迫下的Eisosome组装相关基因表达变化。CK（对照）为不加酸，AA为8 g/L乙酸，LA为30 g/L乳酸。

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基因pil1、fhn1和sle1对维持eisosomes的完整性至关重要

共聚焦结果显示完整的Eisosomes分布于细胞膜的表面，呈现出致密、连续不间断的线条状（图4a）。在基因缺失突变 pil2Δ，eis1Δ和meu14Δ中，没有观察到Eisosomes结构与出发菌株存在差异。而基因pil1，fhn1以及sle1的缺失则引起Eisosomes连续性中断以及丰度降低。

同时，笔者利用TEM进行观测，发现pil1的缺失显著减少了梨状涡结构的数量(图4b)，其中，WT中Eisosomes数量为2.07个/μm2，而pil1Δ中Eisosomes数量仅为0.21个/μm2，两者相差约10倍(图4c)。

图4. 单个基因pil1、fhn1或sle1的缺失导致了Eisosomes的破坏。(a) WT Pil1-EGFP、pil2Δ Pil1EGFP、eis1Δ Pil1-EGFP、meu14Δ Pil1-EGFP、pil1Δ Fhn1-EGFP、fhn1Δ Pil1-EGFP和sle1Δ Pil1-EGFP的显微观察。(b)透射电镜观察到的质膜形态。(c) WT和pil1Δ中eisosomes的数量。

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Eisosomes的破坏降低了酵母的耐酸性

比较了不同酸胁迫条件下pil1Δ、fhn1Δ、sle1Δ、pil2Δ、meu14Δ、eis1Δ和WT的生长表型。半定量斑点试验的结果表明，在无酸条件下，这些基因的缺失不影响酵母的生长(图5a)。在16 g/L乙酸(pH=3.84)胁迫下，菌株pil1Δ、fhn1Δ和sle1Δ的生长性能较WT显著下降，而在乙酸胁迫下，pil2、eis1和meu14的缺失并没有引起生长表型的变化。在乳酸胁迫下观察到与乙酸胁迫下相似的生长表型变化。液体发酵生长曲线也与平板实验相一致(图5b)。因此可以推断Eisosomes结构完整性对于维持粟酒裂殖酵母的抗乙酸、抗乳酸能力是不可或缺的。

图5 保持Eisosomes结构完整性有助于维持粟酒裂殖酵母有机酸耐受性。a：半定量点种法评价亲本菌株与基因缺失突变菌株在不同处理条件下的生长性能；b：生长曲线法评价亲本菌株与基因缺失突变菌株在不同处理条件下的生长性能；CK 代表无胁迫处理，AA代表 16 g/L 乙酸，LA 代表 60 g/L 乳酸。

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Eisosomes的破坏加剧了细胞内酸的积累和ROS的升高。

Eisosome是细胞膜的一个子结构域，推测其形态的改变可能会影响细胞膜的性质。因此，采用碘化丙啶染色法分析WT和基因缺失突变体在不同处理条件下的细胞膜完整性。在无酸条件下，碘化丙啶染色细胞的比例为WT的10.5±2.2%，而在8 g/L乙酸和40 g/L乳酸(pH=2.89)胁迫下，分别为22.8±3.8和26.3±4.7%(图6a)。这些结果表明，酸胁迫对细胞膜的完整性有不同程度的破坏。值得注意的是，pil2Δ、eis1Δ和meu14Δ中碘化丙啶染色细胞的比例与WT中无显著差异，但pil1、fhn1或sle1的缺失导致比例显著增加。在酸胁迫下，该比例的增加更为明显。

然后检测了细胞内酸含量和ROS水平。分别用8 g/L乙酸和40 g/L乳酸处理4 h后，WT细胞内乙酸含量为1795.17±124.24 μg/g，乳酸含量为16.56±1.56 mg/g(图6c和d)。在相同处理条件下，pil1Δ菌株的乙酸含量为2579.33±133.13 μg/g，乳酸含量为22.51±0.75 mg/g。与WT相比，细胞内酸含量分别提高了35.93%和43.68%。在fhn1Δ和sle1Δ菌株中也观察到类似的趋势。在无酸条件下，各菌株的ROS水平相近。在酸胁迫下，pil1Δ、fhn1Δ和sle1Δ的ROS水平显著升高，这与细胞内酸积累的增加一致。

图6. 不同基因缺失对细胞膜完整性、细胞内羧酸含量和ROS水平的影响。(a)碘化丙啶染色细胞的百分比。(b)细胞内ROS水平。细胞内积累的乙酸(c)和乳酸(d)。CK(对照检查)表示未加酸，AA表示8 g/L乙酸，LA表示40 g/L乳酸。图a和图b的显著性分析结果为相同处理条件下，不同菌株碘化丙啶染色细胞与ROS水平的比较。图c、d显著性分析结果为各菌株在8 g/L乙酸和40 g/L乳酸胁迫下胞内酸积累的比较。

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Eisosomes破坏对关键膜蛋白和细胞壁完整性的影响

膜蛋白包括Fps1、Ady2、Jen1、Pma1和Pdr18是决定酿酒酵母胞内羧酸积累的关键元素。通过RT-qPCR分析WT和pil1Δ菌株中相关膜蛋白编码基因的相对表达量。相关膜蛋白编码基因包括mug86 (ADY2的同源基因)、pma1 (pma1的同源基因)、pdr1和bfr1(均为PDR18的同源基因)。

如图7a所示，在酸胁迫下，介导羧酸盐进入细胞的基因mug86受到了严重的抑制。在乙酸和乳酸胁迫下，质子泵编码基因pma1表达量均显著上调，这与酸胁迫引起的细胞质酸化密不可分。ABC家族转运蛋白编码基因pdr1在乳酸胁迫下显著上调，而bfr1在乙酸胁迫下显著上调，反映了这两个同源基因对不同羧酸的不同响应。从图7b中，我们发现在无酸条件下，基因mug86在pil1Δ中显著下调，这表明了这个转运体在的Eisosome结构的重要性。而在酸胁迫下，WT和pil1Δ菌株中mug86的表达量较低，说明该基因并不是造成两菌株羧酸含量差异的主要原因。在乳酸胁迫下，pdr1表达水平在pil1Δ中也有下调，但在乙酸胁迫下未见类似情况。

图7.Eisosome组装状态对关键膜蛋白和细胞壁完整性的影响。(a) 不同酸处理1小时膜蛋白编码关键基因的相对表达量的变化。(b) Eisisosome组装状态的影响关键膜蛋白编码基因的表达研究。(c) 不同pH条件下溴酚蓝溶液的吸光度（590nm）(d) 通过葡萄糖依赖的培养基酸化测定WT和pil1Δ的Pma1质子泵活性。(e)刚果红敏感性试验。CK(对照检查)表示无酸AA为8 g/L乙酸，LA为40 g/L乳酸。

此外，笔者还分析了维持细胞内pH值的关键元素质子泵Pma1的酶活性是否受Eisosome形态变化的影响(图7c和7d)。结果表明，WT和pil1Δ经过饥饿处理后，葡萄糖的补充诱导Pma1的激活，将胞内H+排除到胞外。培养基pH在培养过程中逐渐降低并趋于稳定。在WT和pil1Δ的培养体系中，虽然pH值在30 min和300 min有显著差异，但在其他时间点无显著差异。

细胞壁是酵母抵御外界环境干扰的第一道屏障。细胞壁的孔隙率对于羧酸进入细胞的扩散速率也很重要。因此，也考虑了Eisosomes破坏是否影响细胞壁完整性。以pmk1(一种编码细胞壁完整性通路的关键激酶)缺失突变体作为对照。从图7e可以看出，在无酸条件下，pmk1和pil1的缺失并不影响菌株的生长。与WT相比，在2 mg/mL刚果红的存在下，pmk1Δ的生长明显受到抑制，而pil1Δ的生长与WT没有差异，说明pmk1的丢失导致细胞膜完整性的损伤，而Eisosomes的破坏不影响细胞壁完整性。故WT和pil1Δ中羧酸含量的差异与上述膜蛋白和细胞壁没有显著关系。

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Eisosomes破坏对脂质组成的影响

为了阐明Eisosome对细胞膜的影响，笔者对细胞膜脂质组成进行了分析。采用电喷雾电离（ESI）正、负离子模式共检出714种脂质分子，涉及31个亚类。测定结果显示，WT和pil1Δ突变株的总脂质含量分别为48.22±1.36和44.59±2.66 mg/g，两者之间无显著差异(p≈0.103)。

甘油磷脂是最大的一类膜脂。WT突变株的甘油磷脂总含量(45.08±1.29 mg/g)与pil1Δ突变株的甘油磷脂总含量(41.77±2.45 mg/g)相近，且均大于93%。

在亚类方面，与WT相比，pil1的缺失显著降低了PC、PS、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰甘油醇(PG)的相对丰度，而PE和PC(LPC)的含量显著增加(图5a)。Eisosomes的破坏并未引起鞘脂类物质出现较大的改变，仅有鞘磷脂由7.54±0.63μg/g 上调至 24.28±3.33 μg/g。麦角甾醇含量由63.80±7.62 μg/g下降到42.13±7.05 μg/g。除上述脂类外，pil1Δ中甘油脂类含量也有所下降。

图5 Eisosome改变了S. pombe的脂质结构。(a) WT和pil1Δ突变细胞中不同脂质亚类的分布。(b)具有不同不饱和键的脂类亚类的分布。(c)不同酰基链长度的脂类分布。(d) OPLS-DA分析得到的显著不同脂类的分级聚类(p < 0.05, VIP >1)。

根据报道的酰基链长度分类，发现S. pombe膜脂以超长链脂类(C≥22)为主，其次是长链脂类(12≤C < 21)和少量中短链脂类(C<12)。eiso小体的破坏使超长链脂类的比例从68.39降低到60.29%，主要表现为甘油磷脂和甘油脂的丰度降低(图5b)。从酰基链饱和来看，WT菌株中饱和脂类、单不饱和脂类、多不饱和脂类分别占总脂类的18.73、45.65和35.68%。在pil1Δ突变株中对应比例分别为24.76、42.82和32.29%。由此可见，Eisosomes的破坏导致饱和脂含量增加，不饱和脂含量相应减少。

为了筛选Eisosomes破坏引起的显著差异的脂质标志物，采用正交偏最小二乘判别分析(OPLSDA)对实验组间的差异进行可视化分析。根据VIP >1和P < 0.05的原则，在两株菌中鉴定出32种不同的脂类(图5d)。与WT相比，pil1Δ菌株中LPC(8:0)+HCOO、LPC(10:0)+HCOO、LPC(12:0)+HCOO、LPC(16:0)+HCOO、LPC(16:0)+H等饱和脂质均有所增加。丰度降低的脂类主要有PS、PC和PI，其中PI亚型最多。

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总结

笔者认为Eisosomes破坏引起的细胞膜与内质网信息交流中断可能是导致菌株耐酸性能下降的直接原因，并对Eisosomes参与菌株抵抗有机酸胁迫的机制进行了推测（图6）。乙酸、乳酸以未解离的形式进入胞内引起渗透压变化，从而引起细胞膜张力发生改变。进一步，Eisosomes通过组装状态的改变与VAPs进行沟通，间接地将压力信号传递至内质网，调节内质网的重塑，以维持胞内脂质的稳态和细胞膜的完整性，减少有机酸进入胞内的流量。

图6 Eisosome参与细胞抵抗有机酸胁迫的分子机制

版面设计 马雨鑫

一审/校稿 林良才

二审 崔琬晶

三审 张翠英

关键词： 基因缺失 染色细胞 甘油磷脂